۹

۹٫۱

۹٫۲

۹٫۳

۹٫۴

۹٫۵

۹٫۶

۹٫۷

۹٫۸

۹٫۹

۹٫۹۵

Sufuric acid (ml)

۳۰

۲۷

۲۴

۲۱

۱۸

۱۵

۱۲

۹

۶

۳

۱٫۵

Approx cell density ( ml)

در اینجا ما از استاندارد ۵/۰ مک فارلند استفاده کردیم که تهیه آن به‌صورت زیر انجام شد:
به‌این‌ترتیب که با توجه به مشخصات داده‌شده باریم کلراید را تهیه و بعد از اسیدسولفوریک N36 اسیدسولفوریک N36/0 را تهیه‌کرده و سپس cc5/0 از محلول ۰۴۸/۰ مولار کلرید باریم هیدراته را به cc5/99 اسیدسولفوریک N36/0 اضافه کرده و بعدازاین محلول کدر ایجادشده جهت مقایسه با لوله حاوی میکروارگانیسم استفاده شد. به‌این‌ترتیب که از پلیت حاوی باکتری توسط آنس استریل کلونی برداشته و داخل مقادیر مساوی ازسرم فیزیولوژی استریل حل شد. سپس به مدت ۲ – ۱ ساعت تمام جهت رشد باکتری‌ها و ایجاد کدورت داخل انکوباتور قرار داده شد تا در ۳۷ درجه سانتی گراد رشد نمایند. سپس لوله‌های کدر شده حاوی باکتری را با استاندارد موردنظر مقایسه کرده تا کدورت یکسان باشد. درنهایت از لوله‌های سوسپانسیون توسط سوآپ استریل روی محیط جامد مغذی جهت بررسی آنتی بیوگرام کشت کامل انجام داده شد.
۳-۱-۱۱ تهیه تلقیح میکروبی
ابتدا چند کلونی ایزوله را از محیط کشت باکتری برداشته و در ۱۰ میلی متر آبگوشت حل نموده و در گرمخانه ۳۷ درجه سانتی گراد قرار دادیم و بعد از ۳-۲ ساعت کدورت حاصله با بهره گرفتن از مک فارلند نمره ۵/۰ مقایسه شد. این استاندارد تقریباً معادل باکتری در هر میلی لیتر است. غلظت تعلیق میکروبی بر روی ناحیه ممانعت از رشد مؤثر است. اگر کدورت کمتر از استاندارد مک فارلند باشد زمان بیشتری لازم است تا باکتری تکثیر یابد و در این مدت آنتی بیوتیک فرصت بیشتری برای انتشار دارد و در نتیجه ناحیه ممانعت از رشد بزرگ‌تر می‌شود و برعکس اگر کدورت تعلیق میکروبی بیش از استاندارد مک فارلند باشد روی مرحله تأخیر یا Lag phase از رشد باکتری تأثیر گذاشته و زمان تولید مثل را کمتر می‌کند، در نتیجه فرصت انتشار آنتی بیوتیک کم می‌شود و باعث کوچک شدن ناحیه ممانعت از رشد می‌گردد. بعد از تعلیق میکروبی ظرف مدت ۱۵ دقیقه به محیط کشت مولر هینتون انتقال داده شد.

۳-۱-۱۱-۱ طرز کشت باکتری‌ها روی محیط
باکتری را می‌توان به روش‌های مختلف وارد محیط کشت نمود:
۱- مقداری از سوسپانسیون تهیه شده را در تمام محیط کشت مذاب ۴۵-۴۰ درجه سانتی‌گراد ریخته و با آن مخلوط می‌کنیم و سپس در پلیت‌های استریل تقسیم می‌نماییم. بدین ترتیب سوسپانسیون بطور یکنواخت در محیط پخش می‌شود.
۲- مقداری از سوسپانسیون را در سطح آگار منجمد به طوری که تمام سطح آغشته شود می‌ریزیم، آنگاه زیادی سوسپانسیون را خالی می‌کنیم. در این روش به علت پخش میکروارگانیسم منحصراً در سطح آگار، هاله‌ها یکنواخت نخواهند بود.
۳- سوآپ را به تعلیق میکروبی آغشته نموده و اضافه آن را با فشار دادن سوآپ به کناره لوله حاوی تعلیق میکروبی گرفته سپس سوآپ را در سطح پلیت حاوی محیط مولرهینتون ۳ بار در سه جهت مختلف با زاویه ۶۰ درجه می‌چرخانیم و سپس در حرکت آخر سوآپ را به دور پلیت می‌گردانیم و حاشیه پلیت را هم آلوده می‌کنیم.
۴- عمل دیگر ریختن یک لایه آگار محتوی سوسپانسیون میکروبی روی آگاز مغذی موجود در پلیت‌هاست. در اینجا هاله‌ها با اندازه مناسب رشد می‌کنند ولی نسبت به روش اول مستلزم صرف وقت و دقت بیشتر در پر کردن پلیت‌هاست. در این عمل باید به درجه حرارت آگاز مذاب توجه کرد. اگر خیلی گرم باشد باعث کشته شدن عده‌ای از باکتری‌ها می‌شود و اگر خیلی سرد باشد زود منجمد می‌شود و نمی‌توان با آن کار کرد.
در اینجا از روش سوآپ استفاده کردیم. بدین ترتیب که پس از تهیه شدن سوسپانسیون باکتری مطابق با استاندارد مک‌فارلند در کنار شعله، سوآپ استیل را داخل سوسپانسیون نموده حال روی محیط مغذی مثل مولر هینتون آگار بطور یکنواخت و در تمام جهات کشت می‌دهیم.
۳-۱-۱۱-۲ آنتی بیوگرام
تعیین و سنجش حساسیت باکتری‌ها نسبت به یک عامل ضد میکروبی در Invitro را آنتی‌بیوگرام گویند. برای تعیین حساسیت باکتری‌ها به عامل ضد میکروبی به روش‌های زیر می‌توان عمل کرد:
۱- روش‌های رقتی^[۷]
۲- روش‌های انتشار^[۸]
در هر دو روش، اثر ضد باکتریایی را با بهره گرفتن از اثرات آن در جلوگیری از رشد باکتری‌ها می‌سنجیم.
۳-۱-۱۱-۳روش‌های رقتی
در این روش‌ها از رقیق کردن عامل ضد میکروبی به نسبت‌های معین استفاده می‌شود و خود به دو روش تقسیم می‌شود:
۱- روش لوله^[۹]
۱- Micro dilution method.
۲- Macro dilution method.
این روش کاملاٌ دقیق است ولی به علت صرف وقت زیاد از لحاظ اقتصادی نمی‌توان از آن بصورت روتین استفاده کرد و فقط به مواردی نظیر MIC‌ عوامل ضد میکروبی و آنتی‌بیوتیکی و یا زمانی که باکتری از کشت خون بدست آمده و یا هنگامی که بیماران به دوز مناسب آنتی بیوتیک جواب ندهد، محدود می‌شود. در این روش رقت‌های مختلف از عامل ضد میکروبی را به همراه محیط کشت مایع و غلظت یکسانی از کشت باکتریایی را در لوله‌های متوالی ریخته و پس از سپری شدن مدت زمان لازم، رشد و یا عدم رشد میکروارگانیسم مورد آزمایش را با توجه به غلظت عامل ضد میکروبی ارزیابی کرده و پایین‌ترین غلظتی را که توانسته از رشد میکروب‌ها جلوگیری کند به عنوان MIC عامل ضد میکروب در نظر می‌گیرند. [۶۴]