Amount
Material
۲g
chloride potassium0.05%
۸.۷g
chloride sodium 0.05%
۲.۴g
potassium di-hydrogen phosphate
۱۴.۴g
Disodium phosphate
Up to 1000ml Double distilled water
کیسه دیالیز: کیسه دیالیز به منظور فعال شدن، ۲۰ دقیقه در آب مقطر جوشانده شد و در الکل ۲۵% نگهداری گردید.
۳-۸-۲-۱-۲. روش کار ترسیب پروتئینهای غشایی
نمونهها و محلول اشباع در ظرف یخ قرار گرفته و قطره قطره سولفات آمونیم به آنها اضافه گردید.
نمونهها over night داخل یخ و در یخچال قرار گرفت.
پس از سپری شدن زمان، نمونهها به مدت یک ساعت و در دمای ۳- درجه سانتیگراد با rpm 14000سانتریفیوژ گردیدند. بعد از انجام سانتریفیوژ رسوب حاصله که شامل پروتئین میبود با دقت جمعآوری گردید.
رسوبها با محلول PBS x1 حل گردید.
برای استفاده از کیسه دیالیز با آب مقطر دو بار تقطیر شستشو داده شد.
یک سمت کیسه به خوبی با نخ بسته شد، نمونه داخل آن ریخته شد و سمت دیگر نیز بسته گشت.
کیسه دیالیز به همراه مگنت متصل به آن درون بشر حاوی محلول PBS x1 روی دستگاه گذاشته شد و بعد از انکوباسیون مورد نظر، بافر تعویض گردید (به مدت ۲۴ ساعت).
۳-۸-۲-۱-۳. ترسیب پروتئینهای ترشحی
برای رسوب دادن از روش الکل استفاده گردید، به نحوی که:
نمونهها و الکل در ظرف یخ گذاشته شد و قطره قطره الکل ۶۰% به آنها اضافه گردید.
سپس نمونهها به مدت ۲ ساعت و ۳۰ دقیقه در فریزر قرار گرفت.
پس از زمان مذکور نمونهها به مدت یک ساعت و در دمای ۳- درجه سانتی گراد با rpm 14000سانتریفیوژ شدند. بعد از انجام سانتریفیوژ رسوب حاصله که شامل پروتئین میبود با دقت جمعآوری گردید.
رسوبها با محلول PBS x1 حل گردید.
به نحوی که توضیح داده شد دیالیز گردید (Dennison C., 2002).
تصویر۳-۱: مرحله دیالیز
۳-۸-۲-۲. تعیین غلظت پروتئینها
پس از جداسازی پروتئینها، جهت تعیین غلظت آنها از روش برادفورد(Bradford) توسط اسپکتروفوتومتر در محدوده ی UV-Visible استفاده شد. برای تعیین غلظت پروتئین یک نمونه، رسم منحنی استاندارد به کمک غلظتهای معینی از یک پروتئین استاندارد ضروری میباشد. پروتئین استاندارد مورد استفاده جهت این تست آلبومین سرم گاوی (BSA) بوده که رقتهای مختلف از آن تهیه شد، جذب نوری (OD) رقتها در طول موج ۵۹۵ نانومتر برای هر رقت اندازه گیری شد و نمودار منحنی استاندارد رسم گردید.
۳-۸-۲-۲-۱. مواد مورد نیاز
محلول برادفورد، NaOH 1 مولار و آبمقطر
۳-۸-۲-۲-۲. آماده سازی محلول برادفورد
مطابق جدول زیر مواد وزن گردیده و با آبمقطر به حجم یک لیتر رسانده شد.
جدول ۳-۴: مواد تشکیلدهنده محلول برادفورد
Ml
